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        牛棒桿菌探針法熒光定量 PCR 試劑盒

        簡要描述:牛棒桿菌探針法熒光定量 PCR 試劑盒注意事項:.基礎程序;2.擴增溫度和延伸溫度;3.反應時間;4.循環次數;5.PCR 反應液的配制;6.PCR技術的基本原理;7.PCR的反應動力學;8.PCR擴增產物;9.PCR反應體系與反應條件。

        • 產品型號:GOY-M4152
        • 廠商性質:
        • 更新時間:2023-02-16 15:31:21
        • 訪  問  量:16

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        詳細介紹

         【產品名稱】牛棒桿菌探針法熒光定量 PCR 試劑盒

        Name  :Corynebacterium Bovis Probe qPCR Kit
           【型號:GOY-M4152

        【包裝規格】50次/盒    
        5.png                                                                

        【預期用途】牛棒狀桿菌病(Bovine Corynebacteriosis)是指由棒狀桿菌屬(Corynebacterium spp.)的某些細菌引起的膀胱炎和腎盂腎炎。臨床主要特征為頻尿、濁尿、血尿和發熱。該病主要見于成年母牛,多在妊娠期和產后發病。本病分布于世界各地。因此快速靈敏檢測牛棒桿菌具有重要意義。本產品就是為此目的根據 PCR 原理開發的試劑盒,它具有下列特點:

        1. 即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

        2. 引物和探針經過優化,靈敏性高。

        3. 提供陽性對照,便于區分假陰性樣品。

        4. 特異性高,引物是根據牛棒桿菌高度保守區設計,不會跟其他細菌的 DNA 發生交叉反應。

        5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

        6. 本產品只能用于科研。

        【規格及成分】

        成分

        包裝

        2×Probe qPCR MagicMix

        500 μL(本色蓋)

        熒光 PCR 專用模板稀釋液

        1 mL(黃蓋)

        牛棒桿菌探針法 qPCR 引物混 合液

        100 μL(白蓋)

        牛棒桿菌 qPCR 探針

        50 μL(棕色管)

        牛棒桿菌探針法 qPCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL)

        50 μL(黃蓋)

        使用手冊

        1

        【運輸及保存】低溫運輸,-20℃保存,保存期限為 12 個月 

        【自備試劑】樣品 DNA。

        【使用方法】一、稀釋標準曲線樣品

        (以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)。 由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

        1. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。

        2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,用帶芯槍頭,下同)。

        3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震 蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

        4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

        5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

        6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

        牛棒桿菌探針法熒光定量 PCR 試劑盒二、樣品 DNA 的制備 

        7. 如果有 N 個樣品,設置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性 對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為 NC。

        8. 用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式細菌DNAout。本試劑盒免費贈送 20次免DNA 提取的核酸釋放劑,本產品的裂解液可以直接作為 PCR 模板,省略 了 DNA 提取步驟。

        三、Probe qPCR 反應(20μL 體系,在樣品制備室進行)

        9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復,則標記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),6 個用于標準曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復,則標記 N+4 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

        10. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設 置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):

        成分/每管

         

        樣品管

        N+2 個

        RT-PCR

        陰性對照

        標準曲線樣品管

        1-6 管)

        2×Probe qPCR MagicMix

        10 μL

        10 μL

        10 μL

        牛棒桿菌 qPCR 探針

        1 μL

        1 μL

        1 μL

        牛棒桿菌探針法 qPCR 引物混合液

        2 μL

        2 μL

        2 μL

        N+2 個待測 DNA 模板

        7 μL

        -

        -

        超純水

        -

        7 μL

        -

        7 步所得標準曲線樣品稀釋液(2-7 號)

        -

        -

        7 μL(2 號樣到2 號管,3 號樣到 3 號管…)

         11.蓋上蓋子后上機,按面參數進行 RT-PCR:

        過程

        溫度

        時間

        預變性

        95℃

        5 min

        PCR 反應

        40 個循環)

        95℃

        15sec

        60℃

        60sec(采集 FAM 通道的熒光信號)

         四、數據處理

        12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值,再推算出其濃度。

        13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長,有典型擴增曲線,Ct 值應該 小于或等于 30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 40,則為陽性。

         


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